近紅外光譜技術(shù)建立心通口服液快速分析方法

[摘要]： 目的：應(yīng)用聲光可調(diào)濾光器（AOTF）-近紅外光譜技術(shù)和化學(xué)計(jì)量學(xué)方法建立一種 用于心通口服液快速定性、定量分析的新方法。方法：采用 PCA 主成分分析和偏最小二乘法 分別進(jìn)行定性定量分析。結(jié)果：建立的 XT-C 定性分析模型可正確判斷心通口服液；建立的 定量模型準(zhǔn)確性好，葛根素的內(nèi)部交叉驗(yàn)證均方差是 RMSEP=0.137 1，決定系數(shù) R2=0.984 5, 經(jīng)對(duì)外部驗(yàn)正集樣品進(jìn)行外部驗(yàn)證，葛根素預(yù)測(cè)值與真值的相關(guān)系數(shù)是 r2=0.996 4，預(yù)測(cè)值 的平均回收率為 101.9%(RSD=1.189 %,n=5)。方法精密度 RSD 為 1.98% （n=20），方法穩(wěn)定 性 RSD 為 1.57% （n=5）。結(jié)論：該方法是一種簡(jiǎn)便、快速、低耗的新型分析技術(shù)，可用于 為心通口服液的快速定性定量分析。

[關(guān)鍵詞]：聲光可調(diào)濾光器；近紅外光譜技術(shù)；心通口服液；? ?主成分分析；偏最小二乘；

葛根素；快速分析

?心通口服液為臨床用于治療冠心病、心絞痛的常用中成藥,在 2005 版《中國(guó)藥典》中心 通口服液分別以葛根素、丹參素鈉和黃芪甲苷為對(duì)照品采用薄層色譜法定性分析，以葛根素 為指標(biāo)成分，用 HPLC 進(jìn)行定量分析[1]，被分析樣品需要分別進(jìn)行化學(xué)預(yù)處理，操作煩瑣， 完成一個(gè)樣品定性定量分析需要 6-8h。近紅外光譜分析技術(shù)是一種現(xiàn)代高新分析測(cè)試技術(shù)， 國(guó)外應(yīng)用該技術(shù)在西藥成分檢測(cè)與質(zhì)量控制方面已相對(duì)比較成熟，美國(guó)食品藥物管理局

（FDA）、歐洲和加拿大藥物局正式采用近紅外光譜分析技術(shù)取代煩瑣費(fèi)時(shí)的分析方法，國(guó)內(nèi) 在近紅外光譜分析領(lǐng)域也取得了重要進(jìn)展，2005 版《中國(guó)藥典》也將“近紅外分光光度法 指導(dǎo)原則”列入目錄。近年來(lái)，近紅外光譜分析技術(shù)以其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)開(kāi)始應(yīng)用于中藥分析[2–5], 研究工作者多采用傅立葉變換近紅外光譜儀。AOTF-近紅外光譜分析儀它采用了航天技術(shù)中 的“聲光可調(diào)濾光器”（AOTF）作為分光元件，這種新型的近紅外光譜儀具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、體 積小、重現(xiàn)性好和儀器環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)的特點(diǎn)，試驗(yàn)分析既可在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，也可用于現(xiàn)場(chǎng) 即時(shí)分析，現(xiàn)已開(kāi)始應(yīng)用于煙草及化工行業(yè)[6]，本研究采用 AOTF-NIR 光譜分析技術(shù)和化學(xué) 計(jì)量學(xué)方法，建立了心通口服液定性、定量分析數(shù)學(xué)模型，采集一次光譜數(shù)據(jù)即可完成定性、 定量分析，整個(gè)操作過(guò)程可在 3-5min 內(nèi)完成，為心通口服液的快速分析提供了一種新方法， 同時(shí)為實(shí)現(xiàn)心通口服液的在線質(zhì)量監(jiān)控奠定了基礎(chǔ)。

1??? 儀器與試藥

1.1 儀器

美國(guó) BRIMROSE 公司生產(chǎn)的 Luminar 5030 型便攜式 AOTF 技術(shù)近紅外光譜儀，主要部件 有：光學(xué)部分、控制部分、筆記本電腦等。儀器波長(zhǎng)范圍為 1 100 nm~2 300 nm，波長(zhǎng)增量 2 nm，掃描次數(shù)為 300，采用 InGaAs 檢測(cè)器。挪威 CAMO 公司 The Unscrambler 分析軟件。

Waters1525 色譜儀（美國(guó) Waters 公司），Waters 2996 二極管陣列檢測(cè)器，Empower 色譜工 作站。

1.2 試藥

葛根素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào) 110766-200417 供含量測(cè)定用）；甲醇、丙酮為色譜純?cè)噭?；水為超純水?心通口服液樣品（山東魯南厚普制藥有限公司提供）；雙黃連口服液、銀黃口服液、小兒清熱止咳口服液、安神補(bǔ)腦液、藿香正氣口服液、清開(kāi)靈口服液、小兒肺熱咳喘口服液、 健兒消食口服液、鼻竇炎口服液、腦心舒口服液等（購(gòu)自濟(jì)南藥業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司等）。

2?????? 方法與結(jié)果

2.1??? 樣品準(zhǔn)備

2.1.1 校正集與驗(yàn)證集樣品 在定性分析中，選擇山東魯南厚普制藥有限公司提供的 52 個(gè) 不同批號(hào)心通口服液，40 個(gè)樣品組成校正集，12 個(gè)樣品組成驗(yàn)證集。在定量分析中，為消 除建摸樣品的含量范圍和分布對(duì)所建校正模型性能的影響,本研究中除山東魯南厚普制藥有 限公司提供的不同批號(hào)心通口服液樣品以外,還摸擬車間生產(chǎn)條件在實(shí)驗(yàn)室制備部分樣品以 拉大含量分布范圍，共收集樣品 57 批,將 57 批樣品分為校正集和驗(yàn)證集,其中驗(yàn)證集 5 批均 來(lái)自山東魯南厚普制藥有限公司。

2.1.2???? 口服液對(duì)照品?? 分別由雙黃連口服液（Shl01- Shl10）、銀黃口服液（yh01- yh05）、 小兒清熱止咳口服液（qyzk01- qyzk02）、安神補(bǔ)腦液（asbn）、藿香正氣口服液（hxzq）、 清開(kāi)靈口服液（qkl）、小兒肺熱咳喘口服液（fykc）、健兒消食口服液（jexs）、鼻竇炎口服 液（bdy）和腦心舒口服液（nxs）等 10 個(gè)品種組成。

2.2 ?近紅外光譜采集及光譜預(yù)處理

使用美國(guó) Brimrose 公司 Luminar 5030 型近紅外光譜儀，通過(guò)安裝的液體測(cè)量專用光纖 探頭采集樣品的光譜數(shù)據(jù)。準(zhǔn)備 18×180mm 的試管，清洗干凈涼干備用。將 Luminar 5030 近紅外光譜儀通電開(kāi)啟，用專用的網(wǎng)線連接儀器與筆記本電腦，預(yù)熱時(shí)間為 0.5h。

將液體測(cè)量專用探頭安裝到儀器的手持部分，探頭的光程為 10mm，測(cè)量方式為透反射 測(cè)試。測(cè)量時(shí)，將口服液樣品小瓶的密封口打開(kāi)，倒入一備用的試管中，將光纖探頭插入試 管中的液體，液體要將光纖探頭的缺口部分完全覆蓋，輕微晃動(dòng)探頭，將缺口部分可能存在 的氣泡消除，穩(wěn)定以后，開(kāi)始掃描光譜。掃描完成，將探頭取出，用吸水紙擦拭干凈殘留液 體后，進(jìn)行下一個(gè)樣品的掃描。每一張光譜都是 100 次掃描的平均結(jié)果，波長(zhǎng)范圍從 1 100 nm 到 2 300nm，波長(zhǎng)增量為 2nm。每個(gè)樣品重復(fù)掃描 3 次，得到原始光譜。

在建立模型前，首先對(duì)掃描得到的原始吸收光譜進(jìn)行光譜預(yù)處理，以消除噪音和基線漂 移的影響。我們采用的預(yù)處理方法為一階導(dǎo)數(shù) 9 點(diǎn)平滑法（savitzky-golay），經(jīng)一階導(dǎo)數(shù) 處理可以很好地消除樣品由于顏色差別引起的光譜基線偏移和漂移。11 種口服液的原始光

譜與一階微分光譜見(jiàn)圖 1.

A、B－心通口服液???? C、D－雙黃連口服液???? E、F－銀黃口服液???????? G、H－其它 8 種口服液

2.3 ?建立心通口服液定性分析模型

在 52 個(gè)心通口服液樣品中，隨機(jī)取出 40 個(gè)樣品組成校正集（名稱為 xt-c），用于建立 心通口服液 XT-C 定性分析模型，其余 12 個(gè)樣品作為驗(yàn)證集（名稱為 xt-v），用來(lái)驗(yàn)證所建 立 模型 的 預(yù)測(cè)能 力 。 將 校正 集 樣品 光譜 經(jīng) 過(guò) 一 階 微 分處 理 后 的光譜 數(shù)據(jù) 導(dǎo)入 The Unscrambler 分析軟件，然后利用 PCA（主成分分析）對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，建立心通口服 液 XT-C 定性分析模型，40-個(gè)校正集樣品的 PC1、PC2 主成分空間分布圖見(jiàn)圖 2。

2.3.1 檢測(cè)模型效果

2.3.1.1????? 模型預(yù)測(cè)方法?? 對(duì)以 PCA 主成分分析法建立的心通口服液 XT-C 定性分析模型性能 的預(yù)測(cè)，可采用以下兩種方法：一是通過(guò)計(jì)算機(jī) Excel 表格顯示的方法，二是模型區(qū)域判別 法，見(jiàn)圖 3。在圖 3 左側(cè)表格中，如果在 Excel 表中樣品編號(hào)后面是空白，說(shuō)明該樣品被檢 測(cè)為不屬于 XT-C 模型內(nèi)樣品，如果樣品編號(hào)后面有*號(hào)標(biāo)記，說(shuō)明該樣品被檢測(cè)為屬于 XT-C 模型內(nèi)的樣品；圖 3 右側(cè)是當(dāng) cignificance =5%時(shí)校正集樣品形成的 XT-C 模型分布區(qū)域圖， 如果被檢測(cè)的樣品 x 落在 XT-C 定性分析區(qū)域內(nèi)，說(shuō)明被檢測(cè)的樣品屬于心通口服液，反之， 說(shuō)明被檢測(cè)的樣品與建模樣品不相同。

2.3.1.2????? 定性分析模型預(yù)測(cè)已知心通口服液樣品（xt-v 驗(yàn)證集）???? 調(diào)用 40 個(gè)校正集心通

口服液樣品所建立的定性分析模型 XT-C，對(duì) 12 個(gè)驗(yàn)證集樣品進(jìn)行預(yù)測(cè)，得到的結(jié)果見(jiàn)圖 3。 圖 3 右側(cè)圖中在表格中所有 12 個(gè)驗(yàn)證集樣品編號(hào)后面均有*號(hào)標(biāo)記，說(shuō)明他們屬于模型內(nèi)樣 品，在模型區(qū)域圖中，12 個(gè)驗(yàn)證集樣品均落在 XT-C 模型區(qū)域內(nèi)，說(shuō)明被檢測(cè)的樣品與建模 樣品相同，被 XT-C 定性分析模型認(rèn)可，兩種方法都說(shuō)明被檢測(cè)的樣品屬于建模樣品，即是 心通口服液。

2.3.1.3????? 定性分析模型預(yù)測(cè)口服液對(duì)照品??? 調(diào)用 XT-C 定性分析模型，分別對(duì)雙黃連等 10 種口服液對(duì)照品進(jìn)行預(yù)測(cè)，得到的結(jié)果見(jiàn)圖 4-6。由圖 4-6 可見(jiàn)，口服液對(duì)照品在 Excel 表 格中的樣品編號(hào)后都沒(méi)有*號(hào)標(biāo)記，說(shuō)明他們不屬于模型內(nèi)樣品，在模型區(qū)域圖中，口服液 對(duì)照品均沒(méi)有落在 XT-C 模型區(qū)域內(nèi)，以上兩種方法均說(shuō)明被檢測(cè)的樣品與建模樣品不相同， 被 XT-C 定性分析模型排除，即不是心通口服液。

2.4 ?建立心通口服液定量分析模型

2.4.1 HPLC 分析 將上述 57 個(gè)樣品按 2005 版《中國(guó)藥典》心通口服液項(xiàng)下含量測(cè)定方法 測(cè)定樣品中葛根素含量，每份樣品重復(fù)測(cè)定 3 次，相對(duì)偏差小于 1.5%，以 3 次含量測(cè)定結(jié) 果的平均值為樣品中葛根素的含量。

2.4.2 建立 PLS1 數(shù)學(xué)模型 將經(jīng)過(guò)預(yù)處理后的光譜數(shù)據(jù)與 PHLC 分析數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)，采用 偏最小二乘法（PLS1），交叉－驗(yàn)證法（cross-validation），用 The Unscrambler 定量分析 軟件建立定量分析模型。NIR 和 HPLC 測(cè)定的異常值分別采用光譜影響值 Leverage 和化學(xué)值 誤差 Residual 這兩個(gè)統(tǒng)計(jì)量來(lái)檢驗(yàn)剔除。經(jīng)過(guò)異常值的剔除進(jìn)行優(yōu)化，得到了較為理想的 校正模型見(jiàn)圖 7。葛根素模型的主成分維數(shù)為 5，該模型的決定系數(shù) R2=0.984 5, 內(nèi)部交叉 驗(yàn)證均方差 RMSEP=0.137 1。

2.4.3 檢測(cè)模型效果 以 PLS1 建立的葛根素定量分析模型對(duì) 5 份外部驗(yàn)正集樣品進(jìn)行分 析,得到樣品葛根素的 NIR 光譜預(yù)測(cè)值與 HPLC 分析值之間相關(guān)性良好,葛根素 NIR 光譜預(yù)測(cè) 值與 HPLC 測(cè)定真值的相關(guān)系數(shù) r2=0.9956.

2.4.4 精密度實(shí)驗(yàn) 取 1 個(gè)預(yù)測(cè)樣品,重復(fù)掃描 20 次,將所得光譜帶入建立的葛根素定量分 析模型計(jì)算含量,以考察方法的精密度,結(jié)果葛根素含量的 RSD 值為 1.98%，說(shuō)明儀器精密度 良好。

2.4.5 ?穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) ?取 1 個(gè)預(yù)測(cè)樣品，每 1h 掃描一次，于 5h 內(nèi)重復(fù)掃描 5 次，考察樣品的穩(wěn)定性,結(jié)果葛根素的 RSD 值為 1.193%，說(shuō)明樣品在 5 小時(shí)內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定。

2.4.6 預(yù)測(cè)回收率實(shí)驗(yàn) 取 5 個(gè)預(yù)測(cè)樣品,分別掃描, 將所得光譜帶入建立的葛根素定量 分析模型中,計(jì)算葛根素預(yù)測(cè)值與 HPLC 測(cè)定的真值之間的比值(預(yù)測(cè)回收率), 葛根素的平 均預(yù)測(cè)回收率為 101.9%,RSD 為 1.189%，結(jié)果見(jiàn)表 1。

表 1 葛根素預(yù)測(cè)回收率結(jié)果（n=5）

Tab 1??? predicted recovery test of puerarin

3?? ?討 論

3.1 心通口服液是由山東魯南厚普制藥有限公司獨(dú)家生產(chǎn)，由不同批號(hào)心通口服液建立的 XT-C 定性分析模型，可對(duì)樣品心通口服液進(jìn)行準(zhǔn)確的判定。同時(shí)，對(duì)銀黃口服液等 10 種口 服液對(duì)照品也能夠準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)為不屬于心通口服液。因此，該模型可用于心通口服液的快速 定性分析；用 57 個(gè)樣品建立的葛根素定量分析摸型，經(jīng)外部驗(yàn)正集樣品驗(yàn)證，葛根素預(yù)測(cè) 值與真值的測(cè)定結(jié)果趨于一致，方法的精密度、穩(wěn)定性和預(yù)測(cè)回收率良好，可滿足藥物分析 的要求。

3.2 采用 Luminar 5030 便攜式近紅外光譜儀對(duì)心通口服液樣品直接進(jìn)行掃描測(cè)定，只需對(duì) 待分析樣品采集一次光譜數(shù)據(jù)，分別調(diào)用定性、定量分析摸型，經(jīng)計(jì)算機(jī)處理在 3-5 分鐘內(nèi) 即可完成定性、定量分析，由計(jì)算機(jī)直接讀取分析結(jié)果，不用化學(xué)預(yù)處理、速度快，效率高。

3.3?? ?鑒于 AOTF 近紅外光譜儀環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)的特點(diǎn)，檢測(cè)過(guò)程既可在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，也可用于

其他場(chǎng)所的現(xiàn)場(chǎng)快速分析，因此，以 AOTF 近紅外光譜技術(shù)建立的心通口服液快速分析方法， 不僅可用于心通口服液在藥品流通領(lǐng)域中的快速質(zhì)量評(píng)價(jià)，而且為建立心通口服液生產(chǎn)過(guò)程 中的在線質(zhì)量鑒控奠定了基礎(chǔ)。